Dosages
de la vitamine B 1.2 par méthode microbiologique
BTQ QIABI 1998
1.
Production industrielle de vitamine B 12 (34 points)
La
biosynthèse de cette vitamine est réalisée uniquement par des souches bactériennes
hautement productrices appartenant principalement aux genres Propionibacterium
et
Pseudomonas.
La vitamine B 12 est produite par un Pseudomonas denitrificans, en fermenteur aéré, en 3 à 5 jours, à pH 7,4 et à une température de 29 °C sur un milieu contenant:
Pour les dosages de routine de la vitamine B 12, on choisit la méthode microbiologique basée sur le caractère de dépendance de certaines souches vis à vis des cobalamines : Lactobacillus leichmanii ATCC 4797, E.coli 113-3 ...
|
|
Saccharose
ou mélasse de betterave |
100
g |
Extrait
de levure |
2
g |
Phosphate
d'ammonium |
5
g |
Sulfate
de magnésium |
3
g |
Sulfate
de manganèse |
200
mg |
Nitrate
de cobalt |
188
mg |
Diméthyl-5,6
benzimidazole |
25
mg |
Sulfate
de zinc |
20
mg |
Molybdate
de sodium |
5
mg |
Eau |
1000
mL |
1.1. Donner le rôle des différents constituants du milieu (le diméthyl-5,6 benzimidazole et le nitrate de cobalt sont indispensables à la synthèse de la structure centrale de la vitamine B 12).
1.2.
Indiquer et justifier les types trophiques de Pseudomonas
denitrificans par rapport à la
source de carbone et par rapport à la source d'énergie.
1.3.
Pseudomonas
denitrificans est une souche aérobie stricte mais elle est également
capable de cultiver en l'absence d'oxygène.
Expliquer
précisément le processus qui permet à cette bactérie de se développer en
anaérobiose. Envisager également l'aspect énergétique.
1.4.
Préciser pourquoi le pH doit être maintenu à 7,4 et la température à 29 °C
et montrer de quelle
façon le pH et la température interviennent sur la croissance bactérienne.
1.5.
Reporter sur la copie les légendes 1 à 8 du document 2. Citer les
dispositifs complémentaires adaptés à la réalisation de la fermentation dans
les conditions opératoires proposées ci-dessus.
1.6.
Après l'incubation, le moût de fermentation est transféré dans un atelier où
l'on extrait la vitamine B 12 et un nouveau cycle de fermentation démarre dans
le fermenteur. Indiquer quels sont les inconvénients d'une culture en batch
(système fermé, culture discontinue) par rapport à la fermentation en continu.
2.1.
Donner le principe du dosage microbiologique d'une vitamine et commenter
l'allure de la courbe : croissance totale = f [vitamine]
2.2.
Méthodes de dosage
Deux
méthodes distinctes sont utilisables:
la
méthode en milieu liquide
la
méthode par diffusion en milieu gélosé.
On
réalise le dosage de la vitamine B 12 produite par fermentation industrielle,
à l'aide de la méthode
par diffusion en milieu gélosé.
Technique:
Un
milieu de culture, carencé en vitamine B 12, est ensemencé dans la masse avec
E coli 113-3 et
coulé à la surface d'une plaque. 4 solutions étalon de vitamine B 12 sont préparées:
E,
= 5 µg/mL
E,=
10
µg/mL
E,
= 20 µg/mL
E3
=
40 µg/mL
Pour
doser la vitamine B 12, il faut, d'abord l'extraire des cellules de Pseudomonas
denitrificans par
un traitement thermique (chauffage à 100 °C).
Deux
essais sont effectués:
Tube
X,: 4 mL de moût de fermentation sont prélevés et on ajoute 6 mL de solution
tampon, puis on
porte
le tube 5
minutes
à ébullition
Tube
X,:
2
mL
de moût de fermentation sont prélevés et on ajoute 8
mL
de solution tampon, puis on
porte
le tube 5
minutes
à ébullition.
Des disques de papier filtre imbibés avec E, E2, E3, E,, X, et X2 sont disposés à la surface de la gélose préalablement ensemencée avec la souche d'E. coli. Après 24 heures d'incubation à 30 °C, on obtient les résultats présentés dans le document 3.
2.2.1.
Tracer, sur du papier millimétré, la courbe: diamètre moyen = f (log
[vitamine B 12]). Prendre pour origine des abscisses : log El
Prendre
pour origine des ordonnées: d,,,,,
de E2.
Échelles: 2 cm sur l'échelle des ordonnées correspondent à 1 mm de diamètre moyen 2 cm sur l'échelle des abscisses correspondent à 0,1 unité log[vit B 12]
2.2.2. Calculer la concentration de la vitamine B 12 produite en mg/L de moût de fermentation.