Dosages de la vitamine B 1.2 par méthode microbiologique BTQ QIABI 1998

 

1. Production industrielle de vitamine B 12 (34 points)

La biosynthèse de cette vitamine est réalisée uniquement par des souches bactériennes hautement productrices appartenant principalement aux genres Propionibacterium et Pseudomonas.

La vitamine B 12 est produite par un Pseudomonas denitrificans, en fermenteur aéré, en 3 à 5 jours, à pH 7,4 et à une température de 29 °C sur un milieu contenant:

 

Pour les dosages de routine de la vitamine B 12, on choisit la méthode microbiologique basée sur le caractère de dépendance de certaines souches vis à vis des cobalamines : Lactobacillus leichmanii ATCC 4797, E.coli 113-3 ...

 

 

 

Saccharose ou mélasse de betterave

100 g

Extrait de levure

2 g

Phosphate d'ammonium

5 g

Sulfate de magnésium

3 g

Sulfate de manganèse

200 mg

Nitrate de cobalt

188 mg

Diméthyl-5,6 benzimidazole

25 mg

Sulfate de zinc

20 mg

Molybdate de sodium

5 mg

Eau

1000 mL

1.1. Donner le rôle des différents constituants du milieu (le diméthyl-5,6 benzimidazole et le nitrate de cobalt sont indispensables à la synthèse de la structure centrale de la vitamine B 12).

1.2. Indiquer et justifier les types trophiques de Pseudomonas denitrificans par rapport à la source de carbone et par rapport à la source d'énergie.

 

1.3. Pseudomonas denitrificans est une souche aérobie stricte mais elle est également capable de cultiver en l'absence d'oxygène.

Expliquer précisément le processus qui permet à cette bactérie de se développer en anaérobiose. Envisager également l'aspect énergétique.

 

1.4. Préciser pourquoi le pH doit être maintenu à 7,4 et la température à 29 °C et montrer de quelle façon le pH et la température interviennent sur la croissance bactérienne.

 

1.5. Reporter sur la copie les légendes 1 à 8 du document 2. Citer les dispositifs complémentaires adaptés à la réalisation de la fermentation dans les conditions opératoires proposées ci-dessus.

 

 

1.6. Après l'incubation, le moût de fermentation est transféré dans un atelier où l'on extrait la vitamine B 12 et un nouveau cycle de fermentation démarre dans le fermenteur. Indiquer quels sont les inconvénients d'une culture en batch (système fermé, culture discontinue) par rapport à la fermentation en continu.

 

 

2.1. Donner le principe du dosage microbiologique d'une vitamine et commenter l'allure de la courbe : croissance totale = f [vitamine]

 

2.2. Méthodes de dosage

Deux méthodes distinctes sont utilisables:

la méthode en milieu liquide

la méthode par diffusion en milieu gélosé.

On réalise le dosage de la vitamine B 12 produite par fermentation industrielle, à l'aide de la méthode par diffusion en milieu gélosé.

Technique:

Un milieu de culture, carencé en vitamine B 12, est ensemencé dans la masse avec E coli 113-3 et coulé à la surface d'une plaque. 4 solutions étalon de vitamine B 12 sont préparées:

E, = 5 µg/mL

E,= 10 µg/mL

E, = 20 µg/mL

E3 = 40 µg/mL

Pour doser la vitamine B 12, il faut, d'abord l'extraire des cellules de Pseudomonas denitrificans par un traitement thermique (chauffage à 100 °C). Deux essais sont effectués:

Tube X,: 4 mL de moût de fermentation sont prélevés et on ajoute 6 mL de solution tampon, puis on

porte le tube 5 minutes à ébullition

Tube X,: 2 mL de moût de fermentation sont prélevés et on ajoute 8 mL de solution tampon, puis on

porte le tube 5 minutes à ébullition.

Des disques de papier filtre imbibés avec E, E2, E3, E,, X, et X2 sont disposés à la surface de la gélose préalablement ensemencée avec la souche d'E. coli. Après 24 heures d'incubation à 30 °C, on obtient les résultats présentés dans le document 3.

 

2.2.1. Tracer, sur du papier millimétré, la courbe: diamètre moyen = f (log [vitamine B 12]). Prendre pour origine des abscisses : log El

Prendre pour origine des ordonnées: d,,,,, de E2.

Échelles:      2 cm sur l'échelle des ordonnées correspondent à 1 mm de diamètre moyen 2 cm sur l'échelle des abscisses correspondent à 0,1 unité log[vit B 12]

2.2.2. Calculer la concentration de la vitamine B 12 produite en mg/L de moût de fermentation.